01
摘要
吸入鼠疫耶尔森氏菌会引起原发性肺炎鼠疫，这是以中性粒细胞大量涌入肺部为特征的最严重的鼠疫类型之一。中性粒细胞在原发性肺炎鼠疫中无效，不能控制鼠疫耶尔森氏菌在呼吸道中的生长。然而，鼠疫耶尔森氏菌抵抗中性粒细胞杀伤的机制尚不完全清楚。在这里，我们显示鼠疫耶尔森氏菌抑制中性粒细胞脱粒，而这是宿主固有免疫防御的重要方式。我们观察到鼻内感染耶尔森氏菌的小鼠肺里中性粒细胞在整个疾病过程中均无法释放初级颗粒。使用一种III型分泌系统（T3SS）注射报告株，我们直接确定鼠疫耶尔森氏菌通过T3SS依赖性机制抑制中性粒细胞的释放。组合突变分析显示，同时缺乏两种效应子YopE和YopH的鼠疫耶尔森氏菌菌株在体内和体外均不能抑制初级颗粒的释放，并被中性粒细胞杀死。同样，仅注射YopE或YopH的鼠疫耶尔森氏菌就能大多数抑制人嗜中性粒细胞释放初级颗粒。我们确定了YopE和YopH分别阻止Rac2激活和钙流产生，从而抑制分离纯化的人中性粒细胞中初级颗粒的释放。这些结果证明鼠疫耶尔森氏菌通过两个不同效应子协调了对嗜中性白细胞释放颗粒的抑制作用，这种作用促进了鼠疫耶尔森氏菌在原发性肺炎鼠疫中进程中的存活。
中性粒细胞能迅速从血液中被募集到感染部位，因此，它们是最早对入侵的病原体做出反应的免疫细胞之一。中性粒细胞利用多种机制控制细菌，例如吞噬作用，氧化爆发，中性粒细胞胞外陷阱和脱粒。脱粒是中性粒细胞将预先形成的囊泡（成为颗粒）动员到吞噬溶酶体用来杀死细胞内细菌，或是动员到细胞外用于胞外释放。中性粒细胞中包含的颗粒可以大致分为四种主要类型：初级，次级，第三级和分泌型。其中，初级颗粒被认为是最具促炎性和抗菌性的，含有弹性蛋白-酶，髓过氧化物酶和多种抗菌蛋白。因为其中的许多化合物会破坏宿主组织，初级颗粒需要最强的刺激才能在胞外释放，并在严重感染时作为最后防御手段。
吸入含有鼠疫耶尔森氏菌的雾化液滴会导致原发性肺炎，它属于最致命的肺炎类型之一。吸入后，耶尔森氏菌会在疾病的无症状早期在肺中迅速生长。然后疾病迅速发展为急性肺炎，其特征是严重的肺部炎症和大量嗜中性粒细胞的涌入，但后者却无法限制鼠疫耶尔森氏菌的生长。鼠疫耶尔森氏菌与肺中的中性粒细胞紧密相关，但这些相互作用对原发性肺鼠疫的后果还不清楚。
鼠疫耶尔森氏菌需要III型分泌系统（T3SS）才能致病。T3SS可以通过称为耶尔森氏菌外蛋白（Yops）的针状器官将细菌效应子直接转移进宿主细胞的细胞质。鼠疫耶尔森氏菌靶向天然免疫细胞来注射Yop。在原发性肺鼠疫期间，中性粒细胞是鼠疫耶尔森氏菌T3SS注射的主要目标。Yops抗炎症反应，抗吞噬，且具有多个的靶标和协同作用。耶尔森氏菌利用T3SS抑制吞噬作用，氧化爆发，细胞凋亡和细胞因子的生成，从而使得嗜中性粒细胞中和细菌的大部分机制无效。然而，鼠疫耶尔森氏菌在感染过程中能改变中性粒细胞脱粒能力尚未有研究报道。
使用我们实验室开发的小鼠原发性肺炎鼠疫模型，我们报道中性粒细胞在肺部感染期间无法释放初级颗粒。我们确定鼠疫耶尔森氏菌直接通过T3SS效应器YopE和YopH的递送来抑制中性粒细胞脱粒。在鼠疫耶尔森氏菌感染期间，YopE抑制Rac2活化，YopH抑制钙流产生，这两个都是中性粒细胞胞吐作用产生初级颗粒过程中独特且关键的步骤。总而言之，这里的数据呈现完成了我们对鼠疫耶尔森氏菌通过T3SS介导的机制抑制中性粒细胞抗菌防御能力这一现象的理解。
02
结果
中性粒细胞在原发性肺炎鼠疫中无法释放初级颗粒。
为了评估原发性肺炎鼠疫中肺的中性粒细胞脱颗粒，我们聚焦于中性粒细胞释放初级颗粒的过程，该过程是中性粒细胞控制细菌感染的最后一次尝试。初级颗粒胞吐后，膜结合CD63会在中性粒细胞表达。因此，暴露在中性粒细胞上的CD63可以作为颗粒释放的一个粗略替代检测指标。老鼠鼻内接种CFU鼠疫耶尔森氏菌（％致死剂量[LD]），并收集在整个促炎期各个时间点的肺组织细胞，通过检测CD63+中性粒细胞的比例评估初级颗粒的释放。图1A是其代表性流式图。在接种后36小时（hpi）从肺中收集到了超过个CFU的鼠疫耶尔森氏菌，而在52hpi时数量增长了约10倍（图1B）。同时，我们观察到大量中性粒细胞的涌入，在52hpi时中性粒细胞占肺细胞总数的45％（图1C）。尽管有这些促炎条件，中性粒细胞释放初级颗粒（CD63+）的比例很低，与模拟感染小鼠中中性粒细胞脱颗粒的水平相似（图1D）。这些数据表明在原发性肺炎期间被募集到肺部的中性粒细胞不会释放初级颗粒。
在革兰氏阴性菌引起的细菌性肺炎中中性粒细胞缺失释放初级颗粒功能的现象并不典型。
接下来，我们检查了是否在原发性肺鼠疫中缺乏初级颗粒的释放是肺部感染的常见宿主反应。像鼠疫耶尔森氏菌一样，肺炎克雷伯氏菌是一种细胞外革兰氏阴性菌，能引起急性中性粒细胞性肺炎。我们给小鼠分别通过鼻内感染接种了CFU鼠疫耶尔森氏菌或CFU肺炎克雷伯菌以匹配疾病两种感染之间的进展，以比较两种肺中性粒细胞的脱颗粒反应。鼠疫耶尔森氏菌和肺炎克雷伯菌在我们分析的两个时间点均有相似的高细菌负荷，在36hpi时肺中约有5xCFU，到了48hpi数量约升高10倍（图2A）。另外，小鼠鼻内接种鼠疫耶尔森氏菌或肺炎克雷伯氏菌均能导致肺中性粒细胞的涌入，在36和48hpi时，中性粒细胞占总肺细胞的40％至50％（图2B）。但相比之下，来自肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的中性粒细胞释放初级颗粒（CD63+）的比例显著高于鼠疫耶尔森氏菌感染的小鼠或模拟感染的小鼠（图2C）。该颗粒的释放与用鼠疫耶尔森氏菌或肺炎克雷伯氏菌接种时肺中的弹性蛋白酶（包含在初级颗粒中）含量相关（参见补充图中的图S1）。因此，在原发性肺炎期间观察到的缺乏初级颗粒释放的现象并不是革兰氏阴性病原体感染肺部时发生的普遍反应。
鼠疫耶尔森氏菌通过III型分泌系统注入直接抑制中性粒细胞初级颗粒的释放。
初级颗粒在中性粒细胞激活后需要强烈刺激才能释放至胞外。因此，没有初级颗粒的释放可能是由于中性粒细胞活化程度低或鼠疫耶尔森氏菌引起的抑制作用。我们在之前的研究中阐明了中性粒细胞是原发性肺鼠疫中T3SS注入过程中主要的肺细胞靶点。为评估T3SS注射是否抑制了中性粒细胞的初级颗粒释放，我们建立了鼠疫耶尔森菌Δyop，它表达了T3SS的针状装置，但缺少七个主要的Yop效应器。我们给小鼠分别鼻内接种了带有CFU的鼠疫耶尔森菌野生型或Δyop菌株，使用了更高接种量来刺激中性粒细胞明显募集到小鼠肺部。鼠疫耶尔森菌Δyop未能在肺中增殖，与鼠疫耶尔森氏菌野生型CFU相比，在24hpi时出现4个对数的降低，在36hpi时出现6个对数的降低（图3A）。此外，野生型鼠疫杆菌与感染鼠疫杆菌Δyop在24和36hpi时分别相比，有更大比例的中性粒细胞被募集到感染小鼠的肺部（图3B）。但是，只有来自鼠疫耶尔森菌Δyop感染小鼠肺中的中性粒细胞具有初级颗粒释放（CD63+）能力的细胞比例明显更高（图3C）。因此，某种或多种T3SS效应子能够在鼠疫耶尔森氏菌感染时抑制中性粒细胞初级颗粒的胞吐作用。
接下来，我们假设T3SS注入系统能够直接抑制嗜中性粒细胞脱粒。为了鉴别出T3SS注入的中性粒细胞，我们使用了鼠疫耶尔森菌YopE-TEM和染料CCF2-AM，它通过荧光共振能量转移（FRET）发出绿光。鼠疫杆菌YopE-TEM包含野生型YopE蛋白和β-内酰胺酶，后者与YopE的N末端个氨基酸融合。该菌株感染时T3SS注入中性粒细胞会导致细菌上的CCF2-AM发生剪切和FRET的破坏，染料荧光从绿色变为蓝色。这种方法允许我们在鼠疫耶尔森氏菌感染期间比较同一个肺内未注入的中性粒细胞（绿色）或发生注入的中性粒细胞的脱颗粒情况，如代表图3D所示。小鼠通过鼻内接种CFU鼠疫耶尔森菌YopE-TEM，然后在分析的每个时间点，相同的小鼠肺内T3SS注入的中性粒细胞未注射的中性粒细胞释放初级颗粒的比例（CD63+的中性粒细胞）明显减少（图3E）。这些数据共同表明，鼠疫耶尔森氏菌在整个原发性肺炎感染的过程中以T3SS依赖的方式直接抑制中性粒细胞初级颗粒在肺中的释放。
III型分泌系统效应因子YopE和YopH抑制中性粒细胞初级颗粒释放。
为了确定哪个T3SS效应子抑制了初级颗粒释放，我们使用了体外人中性粒细胞注入和脱粒实验方法，评估了各种yop突变体感染分离出的嗜中性粒细胞后初级颗粒的释放情况。首先，我们用鼠疫耶尔森氏菌的野生型，Δyop或主要T3SS效应子单个yop缺失菌株：YopE，YopH，YopJ，YpkA，YopT和YopM接种人中性粒细胞。感染一小时后，我们使用流式细胞仪以量化中性粒细胞表面的CD63平均荧光强度（MFI），这个参数与初级颗粒的释放水平成正比。这个体外实验的结果证实了体内结果的正确性，即感染野生型鼠疫耶尔森氏菌的人嗜中性粒细胞CD63MFI较低，与模拟感染小鼠的中性粒细胞MFI相似。此外，鼠疫耶尔森氏菌Δyop感染的中性粒细胞初级颗粒释放水平很高（图4A）。每个单一的yop删除菌株感染的中性粒细胞都具有较低水平的初级颗粒释放，类似于鼠疫耶尔森氏菌野生型感染的中性粒细胞（图4A）。因此，单个效应子的损失不足以逆转T3SS介导的脱粒抑制作用。这表明有多个Yops抑制了初级颗粒的释放。
为了确定哪种Yops抑制初级颗粒释放，我们设计了一个组合基因删除方法，并创建了两株鼠疫耶尔森氏菌，每株均缺失一半的Yop效应器。结果表明缺乏YopE，YopH，YopJ和YpkA的鼠疫耶尔森氏菌感染的人中性粒细胞具有较高的初级颗粒释放水平（高CD63MFI），与感染了鼠疫耶尔森菌Δyop的中性粒细胞的水平相似（图4B）。而缺乏YopT，YopM和调控蛋白YopQ的鼠疫耶尔森氏菌感染的人中性粒细胞具有低水平的初级颗粒释放（CD63MFI低），类似于感染了野生型鼠疫耶尔森氏菌（图4B）。这些数据表明，YopE，YopH，YopJ，和/或YpkA抑制了鼠疫耶尔森氏菌感染期间中性粒细胞初级颗粒的释放。
接下来，我们测试了YopE，YopH，YopJ和YpkA中是否有两个效应子对于抑制初级颗粒的释放是多余的。我们建立了四个候选Yops所有两两组合删除的菌株，这些双缺失中的每一个都接种了人嗜中性粒细胞，然后测量其初级颗粒释放水平（CD63MFI）。只有感染了鼠疫耶尔森菌ΔyopEH的中性粒细胞初级颗粒释放水平很高（高CD63MFI），尽管水平不如鼠疫耶尔森氏菌Δyop感染的中性粒细胞高（图4C）。而剩下的其他双重Yop缺失菌株感染的中性粒细胞初级颗粒释放均受到了抑制（低CD63MFI），类似于感染了野生型鼠疫耶尔森氏菌的中性粒细胞（图4C）。除了ΔyopEH菌株以外的双缺失突变体都抑制了初级颗粒的释放，这表明YopE和YopH抑制中性粒细胞初级颗粒释放是必需的。
YopE和YopH在肺鼠疫中独立抑制初级颗粒的释放。
为了确定YopE和YopH在体内是否也能抑制嗜中性粒细胞初级颗粒的释放，我们利用原发性肺鼠疫模型测试了YopE和YopH缺失突变体。根据分离的人嗜中性粒细胞的体外实验结果（图4A至C），我们预测只有接种了鼠疫耶尔森菌Δyop或ΔyopEH（缺乏YopE和YopH）菌株的小鼠中性粒细胞会胞吐初级颗粒。我们分别对小鼠通过鼻内接种了CFU的鼠疫野生型，Δyop，ΔyopE，ΔyopH或ΔyopEH菌株，在24hpi时诱导明显的中性粒细胞涌入肺部现象，以比较不同菌株之间中性粒细胞颗粒释放的区别。正如我们之前观察到的，与野生型鼠疫耶尔森氏菌相比，鼠疫耶尔森菌Δyop的生长在24hpi时受到了阻害（图5A）。我们从接种了鼠疫耶尔森氏菌Δyop或ΔyopEH菌株的小鼠的肺中平均获得CFU菌量，从接种鼠疫耶尔森菌ΔyopH的小鼠肺中获得了CFU，而接种了鼠疫耶尔森氏菌ΔyopE或野生型菌株的小鼠肺中获得了约CFU（图5A）。鼠疫耶尔森氏菌ΔyopEH在肺中的毒力缺陷表明YopE和YopH于原发性肺炎鼠疫的重要性。尽管细菌载量有差异，所有接种了鼠疫耶尔森氏菌菌株的小鼠的肺部中性粒细胞的比例都很相似（占肺细胞总数的20％-25％），除了鼠疫耶尔森菌ΔyopEH，其中只有10％的肺细胞是中性粒细胞（图5B）。与我们的预测一致，与模拟接种小鼠的嗜中性粒细胞相比，只有鼠疫耶尔森氏菌Δyop或ΔyopEH接种感染的小鼠的中性粒细胞具有明显的初级颗粒释放能力（CD63+）（图5C）。另外，单缺失ΔyopE和ΔyopH菌株仍然能够抑制中性粒细胞初级颗粒的释放，进一步支持我们对于YopE和YopH能独立阻断嗜中性粒细胞脱粒能力的预测。
鼠疫耶尔森氏菌通过抑制中性粒细胞Rac2活化和钙通量阻断初级颗粒释放。
YopE是一种GTPase激活蛋白，可以使Rho家族的GTPases失活。已证明耶尔森氏菌假结核YopE可以抑制中性粒细胞的Rac2激活。YopH是一种蛋白质酪氨酸磷酸酶，可通过去活化多种宿主细胞激酶通路（包括PLC/SLP76信号转导轴）来抑制钙流通量。Rac2激活和钙通量对于中性粒细胞释放初级颗粒都至关重要。Rac2激活触发肌动蛋白聚合反应，从而将初级颗粒引导至质膜，而在这里颗粒与质膜融合发生胞吐过程必需钙流帮助。单一抑制这两个过程之一就可以完全阻止初级颗粒的释放。因此，我们假设鼠疫耶尔森氏菌YopE抑制Rac2活化，而YopH抑制钙流量来阻止初级颗粒从中性粒细胞中释放（图6A）。因为抑制Rac2活化或钙通量都可完全抑制嗜中性粒细胞的初级颗粒释放，我们预测这两个YopE（抑制Rac2激活，协调了原始颗粒结合至质膜）和YopH（抑制了能让质膜释放初级颗粒的钙流）足以阻止鼠疫耶尔森氏菌感染期间嗜中性粒细胞释放初级颗粒。我们构建了三种菌株，分别删除了整个T3SS效应子，除了分别保留了Typ（仅YopE），YopH（仅YopH），或YopE和YopH（“仅YopEH”）。我们在体外用这些菌株感染了人嗜中性粒细胞，分别通过流式细胞仪定量测量初级颗粒的释放水平（通过检测细胞表面的CD63）。接种鼠疫耶尔森氏菌YopE或YopH的中性粒细胞初级颗粒释放水平均被显著抑制了（低CD63MFI），这与接种YopE和YopH的鼠疫菌株的人中性粒细胞水平类似（图6B）。因此，YopE和YopH均可通过靶向单独但关键的分子充分抑制中性粒细胞初级颗粒的释放过程。这些数据与我们之前的实验结果一致，即仅同时缺少YopE和YopH（例如Δyop或ΔyopEH菌株）的鼠疫耶尔森氏菌突变体会抑制中性粒细胞初级颗粒的释放。
为了测试YopE和YopH是否是靶向Rac2激活和钙通量以抑制中性粒细胞初级颗粒的释放，我们分别使用了其对应的化学抑制剂来模仿鼠疫耶尔森氏菌感染中性粒细胞期间YopE或YopH的抑制作用。使用我们的体外人类嗜中性粒细胞感染方法，我们对中性粒细胞分别用EHT（Rac抑制剂，模仿YopE的作用）或BAPTA-AM（钙螯合剂，模仿YopH的作用）做了预处理。然后，我们用鼠疫耶尔森氏菌野生型或ΔyopEH菌株分别感染嗜中性粒细胞，通过流式细胞仪测量细胞表面CD63水平定量中性粒细胞初级颗粒的释放情况。不出所料未加药的嗜中性粒细胞感染鼠疫耶尔森菌ΔyopEH后引发了明显的初级颗粒释放（高CD63MFI），同时被鼠疫耶尔森菌野生型菌株感染的中性粒细胞的初级颗粒释放被明显抑制（低CD63MFI）（图6C）。然而，用EHT或BAPTA-AM预处理过的嗜中性粒细胞感染鼠疫杆菌ΔyopEH后其初级颗粒的释放受到了抑制（低CD63MFI）（图6C）。因此化学抑制嗜中性粒细胞中Rac2的活化或钙通量可以分别模拟对YopE或YopH的抑制作用。这也为我们关于YopE和YopH能够阻止两个独立的激活中性粒细胞初级颗粒释放过程的假设模型提供了相关证据（图6A），在这两个Yop效应器中只要一种就足以抑制中性粒细胞脱粒。
在原发性肺炎鼠疫期间，中性粒细胞整个促炎期都与鼠疫耶尔森氏菌保持紧密接触。我们假设YopE和YopH介导的抑制中性粒细胞初级颗粒释放的结果促进了鼠疫耶尔森氏菌的生存，因为Δyop和ΔyopEH菌株（缺乏YopE和YopH）不能在鼻内接种小鼠后在小鼠肺中增殖（图5D）。为了确定中性粒细胞是否直接杀死了鼠疫耶尔森菌Δyop或ΔyopEH，我们分别对人是中性粒细胞体外接种了鼠疫耶尔森菌野生型，Δyop或ΔyopEH菌株，并通过测定在感染过程中不同时间点的CFU来计算细菌存活率。鼠疫耶尔森氏菌与中性粒细胞共培养6小时后，野生型CFU增加了10倍。但在感染仅2小时后，鼠疫Δyop和ΔyopEH菌株的CFU已降低。在4hpi时CFU有部分恢复，但从4hpi至6hpi两种菌株均未能发生增殖（图6D）。这些数据证明了YopE和YopH在促进鼠疫耶尔森氏菌与嗜中性粒细胞最初相互作用期间的存活的必要性。
03
结论
综上所述，我们的数据突出了鼠疫耶尔森氏菌产生毒力的一种策略，即通过T3SS注入抑制中性粒细胞行使功能从而破坏中性粒细胞反应的平衡，导致它们无效：鼠疫耶尔森氏菌在初次接触中性粒细胞时即抑制后者脱粒，然后当鼠疫耶尔森氏菌细菌载量增加至失控时中性粒细胞才会发生过度的脱粒现象。在鼠疫耶尔森氏菌感染期间改变肺中性粒细胞的数量可以克服T3SS介导的中性粒细胞脱粒功能失效现象并改善疾病结果，这一现象也对上文的毒力策略给出了支持。诱导中性粒细胞尽早募集到原发性肺鼠疫期间的肺部也能增强对鼠疫耶尔森氏菌增殖的控制和降低疾病的严重程度。采取相反的方法，耗尽中性粒细胞对鼠疫耶尔森氏菌的生长无影响，但可显著减少对晚期宿主的损害和疾病严重程度，大概是因为在感染的最后阶段，肺中存在的脱颗粒的中性粒细胞数量较少。因此，鼠疫耶尔森菌与肺功能性中性粒细胞的数量的平衡对感染的结果有着至关重要的作用，鼠疫耶尔森菌抑制颗粒的释放对鼠疫耶尔森氏菌打破这个平衡，使病程趋向于严重的肺炎和高病毒毒力非常重要。
译者按：文中所有图均是使用AttuneNxT完成的。
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原文标题：InhibitionofNeutrophilPrimaryGranuleReleaseduringYersiniapestisPulmonaryInfection.
作者：EichelbergerKR,JonesGS,GoldmanWE.
来源：ResearchGatem,,10(6).
翻译部分：面包树
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